Flavivirus reverse genetic systems, construction techniques and

傲慢与偏见

Flavivirus reverse genetic systems, construction techniques and applications: A historical perspective

傲慢与偏见

摘要：
黄热病毒，在热带和亚热带引起一些人类虫媒病毒疾病。
反向遗传学技术自1989年首次应用于研究黄热病病毒，其后，该技术用于对其他黄病毒的研究。
反向遗传学技术彻底改变了对这些病毒的研究，使操纵它们的基因组成为可能，用于病毒的生物学和致病性的细微变化评价。
最常用的反向遗传系统是感染性克隆技术。黄病毒感染克隆技术成为一个强大的工具，但它们构建成为全长cDNA分子的细菌载体存在技术问题，费时费力，因为它们在细菌中往往不稳定，发生一些诱导突变，或者产生的病毒蛋白表达可能对细菌有毒。
过去30年，生物学取得一些令人难以置信的技术，如PCR或NGS等，给黄热病毒感染性克隆的构建带来一些新方法和新策略。
本综述详细介绍了黄病毒反向遗传学技术的发展演变和重大技术突破，以及在进一步了解和控制这些病毒及其疾病方面的应用。

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前言：
根据国际病毒分类委员会的第IX次报告，黄病毒属包含53种毒种，其中40种已知可引起人类疾病，包括登革病毒(DENV)、黄热病病毒(YFV)、日本脑炎病毒(JEV)、西尼罗河病毒(WNV)和蜱传脑炎病毒(TBEV)。
这些病毒每年造成数百万人口感染，从轻微发热症状到致命的出血/神经系统疾病。
在最近几十年，人类，动物，商品通过现代运输造成大量流动，热带发展中国家的没有计划的城市化和缺乏足够的公共卫生基础设施使这些病原体，扩大地理分布范围导致大流行。

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黄病毒是一种小的(50纳米)，有包膜，基因组为单链RNA的病毒。它们的基因组在10.5-11 kb之间，包含一个开放阅读框(ORF)，两侧分别各有一个由100个核苷酸长短的5或者500个核苷酸长短的3个非翻译区域(utr)，形成和基因组复制和蛋白质翻译所需的特定的二级结构。ORF翻译成一个大的前体蛋白，被宿主和病毒蛋白酶裂解，形成结构和非结构病毒蛋白。
结构蛋白(C, prM和E)位于多聚蛋白的N端，非结构蛋白(NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B和NS5)位于多聚蛋白的C端。
基因组的5'端具有I型帽(m7GpppAmp)，而基因组的3‘端缺少一个聚腺苷酸尾。
黄病毒还含有一段独特的区域，约0.3-0.5 kb，位于3端的非编码RNA，被认为是病毒在细胞中复制和调节动物致病性至关重要。
另外，在JEV病毒基因组序列中发现了一个核糖体移码位点，可产生NS1'蛋白，这是NS1蛋白的一种变异体。

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很多正链RNA病毒，包括黄热病毒，在转染敏感细胞时具有感染性，能产生活病毒。
1957年，第一次报道病毒核酸有感染性，如门果病毒，西尼罗脑炎病毒，脊髓灰质炎病毒，东部马脑炎病毒。质粒加入病毒基因组序列，在启动子作用下，进行转录，转染细胞，获得病毒。
感染性克隆可以用于研究病毒特性：如毒力/减毒机制，细胞穿入，复制，宿主范围，基因组编码区/非编码区的功能活性。

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技术发展史
1981年, Racaniello等第一次报道了脊髓灰质炎病毒的感染性克隆。将全长基因分为3个片段克隆到细菌质粒中。
1986年，PCR技术的建立简化了感染性克隆技术，不需要再进行RNA基因组的大量提取和体外转录。
进一步，利用T7或者SP6的体外转录，脂质体转染，电转等技术完善，助力了感染性克隆技术的发展。

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1989年，关于黄热病毒第一个感染性克隆的报道是YFV，因为全长感染性克隆无法构建出来，因此基因组被分成了两个片段，体外连接后，进行体外转录，转染细胞，重新获得重组病毒。后续又有JEV，DENV，kunjin virus (KUNV) ，MVV， (Hurrelbrink et al., 1999), TBEV (Mandl et al., 1997)和WNV (Yamshchikov et al., 2001b)感染性克隆构建成功。
YFV-17D 疫苗株和JEV，DENV2一样，不容易构建单质粒的感染性克隆，依旧采取两步克隆法进行感染性克隆的构建。
在这个发展阶段，需要额外加入一些包括亚克隆，修正PCR，更换骨架载体等额外的工作，往往花费了更多的时间。

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从20世纪80年代末开始，人们争相构建黄热病毒的感染性克隆模型，促进了黄热病毒感染性克隆技术的进步。
PCR和反转录PCR(RT-PCR)的发展，促进了感染性克隆在保真性，构建速度的进步。
目前，尚无商品化的试剂盒，研发可靠的商用分子生物学试剂盒会显著提高黄热病毒的研究。
为了增加感染性克隆在细菌中的稳定性，简单些的病毒用低拷贝质粒载体能解决稳定性问题，复杂些的病毒，可以用体外连接，长片段高保真PCR聚合酶等方法进行改善。

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感染性克隆技术路线：

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在这一阶段，有很多技术涌现出来，有助于黄热病毒感染性克隆的构建：① 长片段高保真PCR技术，优化引物组合，浓度等反应体系。将长片段PCR产物进行体外连接，转录，获得全长RNA，转染细胞，产生病毒，无需进行克隆。但是构建出全长的感染性克隆还是很有必要。
② 测序技术的进步，1996年，第一台商品化的测序仪产生。
③ Dayhoff在1981年第一个建立了核苷酸数据库，并发表了蛋白质数据库的合集。1982年，NIH建立了Genbank数据库，可以及时上传核苷酸序列。伴随着数据库的增长，用于分析序列的软件也顺应得到快速研发，如FASTA和BLAST。
生物信息学的研究也进入起步阶段，用于分析这些序列数据，并用于检验各种假设的正确性。
第一个序列分析软件如MEGA开始出现，为从核苷酸和氨基酸序列比对产生系统发育树提供了可能。