A new class of highly potent, broadly neutralizing antibodies isolated from v...

傲慢与偏见

A new class of highly potent, broadly neutralizing antibodiesisolated from viremic patients infected with dengue virus

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摘要：
目的：登革每年感染病例约4亿，传播迅速，为了促进研制更好的疫苗，了解免疫机制，减少登革热的发生。
方法：从登革患者体内分离出145个人源性单抗，鉴定抗体的抗原表位。
结果：鉴定出一个全新的抗原表位，E蛋白二聚体表位，该位点在连接两个E蛋白形成二聚体处。针对该表位的抗体能和登革的多种血清型发生交叉反应，匹摩尔水平的中和抗体也能中和在蚊虫细胞或者原代人细胞产生的病毒。
结论：本研究的为登革病毒亚单位疫苗的研制提供新思路，对诱导EDE相关抗体类疫苗试验的设计和监控具有指导意义。

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登革通过蚊虫传播，四型病毒氨基酸序列差异大约为30–35%。
被其中任意一型感染，能产生对该型终身的抗体，但是对其他型无效。
登革每年感染病例约4亿，其中1/4有症状，严重可以导致登革出血热，可以出现多器官出血和休克，病情发展迅速，多因中枢性呼吸衰竭和出血性休克在24小时内死亡。
流行病学数据显示，重症病例多为二次感染引起的ADE效应。
目前针对登革的疫苗主要时研制中和抗体，E蛋白是主要的靶蛋白，另外制备4价减毒活疫苗，但是两个临床实验都显示虽然能检测到
DENV病毒颗粒和抗体的识别受病毒蛋白的组成，形态和环境等的影响。
The recognition of DENV particles by antibodies is complicated by several different compositions and conformations of the virus glycoprotein shell that are displayed at different phases of the virus life cycle10,11. The immature viral particle has a full complement of precursor membrane protein (prM) in a 1:1 association with E protein. In an environment of neutral pH, such as in the endoplasmic reticulum lumen in which the particles bud, the immature virion displays a characteristic appearance of 60 spikes, each a heterohexamer (usually referred to as a ‘trimer’) made up of three prM and three E proteins10-13. Exposure to low pH in the Golgi results in a transition at the virus surface in which trimers dissociate and the individual subunits reassociate as dimers, displaying a smooth herringbone lattice of 90 dimers of E protein (‘E dimers’). In these particles, prM is bound at the E-dimer interface, covering the fusion loop and exposing a cleavage site for the host protease furin, which resides in the trans-Golgi network. Following furin-mediated cleavage of prM, mature viral particles are released into the environment; these lose the precursor moiety of prM that results from cleavage by furin. The release of prM primes the particle to become infectious, reacting to the acidic pH of endosomes to induce fusion of viral and endosomal membranes14,15. An important and additional level of complexity is that the cleavage of prM is frequently incomplete, which leads to a population of partially mature viruses with varying degrees of cleavage16. Viruses containing large amounts of prM are not infectious, whereas viruses with lower levels of prM are still infectious; furthermore, it has been postulated that the noninfectious particles with large amounts of prM can be driven to infect by ADE17. Expansion of smooth mature particles into a bumpy form upon exposure to temperatures above 34 °C, in which the E dimers rearrange with respect to each other, has also been described for DENV-2 virions18,19.
Here we examined a large panel of human mAbs that target DENV E protein, which allowed us to delineate the antigenic landscape during natural dengue infection. We have identified a new class of highly potent and broadly reactive antibodies able to neutralize multiple DENV serotypes. Antibodies directed against the envelope dimer epitope (EDE) were the only class of antibody in this study able to neutralize DENV produced in primary human cells.

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样品来源：
血样来源于住院期病人，签署知权同意书。病例通过RT-PCR检测（能确定血清型），针对NS1抗原的胶体金，ELISA实验进一步确诊为DEN感染。
疾病严重程度根据1997年WHO标准而定，在招募病人中，两个患者症状轻微，五个患者症状比较严重。

疾病感染后第6天，DENV特异性的IgM:IgG <1.2被判定为二次感染。
血样用于B细胞分型，分离PBMCs，即刻使用。
实验中用到的细胞包括：C6/36细胞，Vero细胞，U937细胞，293T细胞，表达佛林蛋白的293T细胞，佛林蛋白缺陷型细胞LoVo (CCL-229; ATCC) ，单核来源的树突状细胞。
实验中用到的病毒包括：DENV-1 (Hawaii), DENV-2 (16681), DENV-3 (H87)， DENV-4 (H241)，主要在C6/36中培养病毒，VERO用于噬斑实验。

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分选分泌DENV抗体的单B细胞：
分选中涉及的淋巴细胞表面标志物和抗体有
anti-CD3 (345766; BD Pharmingen), CD3是T淋巴细胞表面标志分子
anti-CD19 (R0808; Dako), CD19是B淋巴细胞表面标志分子，表达于B系细胞及滤泡树突状细胞上，在B细胞的整个分化阶段，或高或低都有表达。
anti-CD20 (345794; BD Pharmingen), CD20是成熟B淋巴细胞表面分子，是B细胞的分化阶段标志物，在原始B淋巴细胞期并不表达。
anti-CD27 (555440; BD Pharmingen)，抗体分泌细胞表面标志分子
anti-CD38 (555462; BD Pharmingen)，抗体分泌细胞表面标志分子
因此，本研究中筛选的抗体分泌细胞为：CD19+, CD3&#8722;, CD20lo to CD20&#8722;, CD27hi and CD38hi。

单B细胞分选至96孔PCR板中，获得的细胞立刻放入干冰上冰冻，转-80℃保存备用，RT-PCR和巢式PCR扩增IgG分子的γ-链, λ-链 和κ-链 。
成对的轻重链基因分别插入真核表达载体，转染293T细胞，收获抗体。
一共获得145株抗体，ELISA检测其中84%和DENV四型病毒株均结合，13%和2-3型病毒株结合，只有3%和一个血清型病毒株结合(Fig. 1a)。
免疫杂交实验显示57%的mAbs（83株）和DENV E蛋白结合(IB+)，43%不结合，但是和全病毒颗粒能结合(IB-)，说明抗原表位在病毒E蛋白之外的其他区域(Fig. 1b)。
IB+ mAbs大多数和病毒四型有交叉反应，而IB- mAbs抗体，62株中有41株和四型有交叉反应(Fig. 1c)。

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Antibody epitope mapping with VLP mutants
DENV-1的 prM/E基因插入到表达载体pHLsec构建病毒样颗粒VLP。成熟的DENV病毒颗粒包含90个二聚体，由180个E蛋白组成二十面体结构，如下图。
，
结合已有文献报道进行预测，对E蛋白的一些表面暴露残基进行定点丙氨酸突变，若残基为丙氨酸，则突变为甘氨酸，一共得到65个VLPs突变体。
VLPs颗粒均一性并不是好，并且比完整的病毒颗粒要小，由30个E二聚体形成。这些区别可能影响到鉴定一些复杂的四级表位（E蛋白之间形成的空间表位）。
比较幸运的是，本研究中的145株抗体都能和作为对照的非突变型VLPs结合，支持VLPs能用于表位定位的研究。ELISA板包被anti-prM，加VLPs，加从病人血清中筛选到的145株抗体，抗体结合能力降低至少>80% 被认为有效，该抗体和改变的表位有关联。
在这145株抗体中，有112株抗体其抗原表位被认为和本研究E蛋白突变处的位点有关，另外用WB检测能和E蛋白结合的33株抗体（见下图，文章附加页的Tab 2，表最下端的33行)，和所有的突变体依然保持很强的结合能力，说明抗原表位在突变点之外的其他位置。

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针对融合环表位(FLE) 的抗体
融合环表位位于E蛋白疏水区，参与病毒在酸性内质环境下和细胞膜融合的反应。
Trp101是FLE27-31表位结合抗体的关键位点，本研究中WB检测和E蛋白结合的83株抗体中，46株对于FLE位点突变反应敏感，说明为FLE特异性抗体，其中40株对Trp101突变反应敏感。另外几株对 FLE表位中的Gly106和Leu107突变反应敏感。
有文献报道西尼罗脑炎病毒WNV针对FLE表位的单抗mAb E53和E蛋白的晶体结构显示和104–110位结合，另外和融合环附近的BC环上的74-79位结合。本研究中的FLE特异性表位，只有两个针对BC环的突变敏感，特性和一个已经报道的针对DEN交叉反应抗体1C19比较相似。

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识别DENV空间表位的抗体
将IB&#8722;单抗（即WB检测不和E蛋白结合的单抗）分为五组：
大部分抗体对融合环Trp101 (W101A) 表位的突变有很敏感的反应。对于识别不同的两个E二聚体依赖性表位的抗体分为两组，EDE1单抗，EDE2单抗。
EDE2抗原表位主要残基在153-155位，能破坏N-糖基化位点。
两外3组包括12个抗体
IB–第3组单抗和EDE1单抗相似，但是同时对 Leu107 和 Lys295位点突变敏感;
IB–第4组单抗对Trp101位点突变不敏感;
IB–第5组的5株单抗对Trp101位点突变敏感，并且是对完整病毒该表位敏感（the epitope was recapitulated only on intact virions，没理解这句）
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经过丙氨酸扫描和表位图谱分析，这145株抗体的相关表位统计结果如下

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ADE效应：病毒感染细胞是从病毒黏附细胞表面开始（attach），病毒通过其某个结构蛋白和细胞上的特异性受体和配体分子相互作用来完成黏附过程。
中和抗体通常可以通过和病毒蛋白结合干扰且阻抑病毒和细胞表面的黏附作用，从而失去感染细胞的能力。
ADE作用则是抗体在病毒感染细胞过程中发挥相反的作用，它们协助病毒进入靶细胞，提高病毒感染细胞的能力，这一现象即称为ADE，抗体依赖性增强作用。

70年代，在研究登革病毒时明确了ADE作用与致病性之间的关系，此后在40余种病毒的感染种发现存在ADE效应。

由于ADE效应的存在，病毒在巨噬细胞和单核细胞种进行繁殖，引发宿主的持续性感染，严重的可以引起患者体内细胞因子风暴，导致死亡。用常规疫苗免疫这些能引起ADE效应的病毒往往难以奏效。