Broadly neutralizing monoclonal antibodies against human adenovirus......

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Broadly neutralizing monoclonal antibodies against human adenovirus types 55, 14p, 7, and 11 generated with recombinant type 11 fiber knob

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摘要：
人B组腺病毒7型、14型、55型常引起儿童和成人重症肺炎甚至死亡，近年来国内外多有爆发流行的报道。
目前没有腺病毒特异性疫苗和治疗药物用于儿童和普通人群。
腺病毒纤毛蛋白是最主要的受体结合蛋白，其头部结构域(纤毛蛋白头,knob)与宿主细胞表面的病毒特异性受体结合完成病毒的吸附。
人B组腺病毒7型、14型、55型、11型均识别细胞表面受体人桥粒芯蛋白2(hDSG2)。
本研究利用大肠杆菌表达系统表达纯化了Ad11纤毛蛋白头(Ad11FK)，Ad11FK免疫小鼠抗血清可以中和Ad11、-7、-14P1和-55。
以Ad11FK为抗原制备单克隆抗体，获得了三株抗Ad11的中和活性单抗6A7、3F11和3D8。体外中和试验表明3F11和3D8可以交叉中和Ad 7、-55，但不能中和Ad14p1。
生物信息学分析表明纤毛蛋白头F-G环中的两个氨基酸251KE252可能是3F11和3D8识别的关键氨基酸，其在Ad11、-7、-14P和-55中高度保守，而在Ad14p1和Ad3中缺失。这两个氨基酸的缺失会破坏Ad11、-7、-14P和-55的短α螺旋结构(248SREKE252)。
本研究加深了我们对于腺病毒纤毛蛋白结构和抗体应答的认识，并对新型腺病毒疫苗和具有广谱活性的抗病毒药物研究具有重要意义。

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背景资料：
截止目前，人腺病毒( human adenoviruses, HAdVs) 一共有85种HAdV型，根据基因组分型分为七大类 A-G。
其中，B型分为两类亚型：
B1, 包括HAdV-3，7, 16, -21, 50
B2, 包括HAdV-11, 14, 34，35，55其中，HAdV-3，-7,-14，-55型病毒是以人桥芯糖蛋白2（hDSG2）作为主要的高亲和力受体。
儿科呼吸道感染常能检测到HAdV3和7型病毒，其中7型感染临床表现更为严重。
此外，HAdV7也是在军队中引起ARD爆发的最为常见的传染源。
HAdV14 (也称为agent de Wi或者HAdV14p)首次发现于1955年一场ARD爆发中，其后消失一段时间，2006年，在美国军队以及城市人群中再次出现，导致至少10人死亡。其后HAdV14p1在欧洲，加拿大，亚洲先后出现。
2006年，HAdV55首次出现在中国，引起军队和城市人群中大规模爆发，成为一个可能导致致死性肺炎的致病源。
进行器官移植的患者常发生腺病毒感染，有很高的致死率，常见的病毒有HAdV-7 和 -11 。


HAdV核衣壳蛋白由3个蛋白构成：
1. HEXON，六邻体蛋白，最为丰富，主要产生一些型特异性中和抗体，包含很多中和抗体表位。六邻体蛋白是腺病毒衣壳二十面体的主要结构蛋白，为同源三聚体，含有大量型，型间，属特异性抗原表位及中和表位等大量的抗原表位，也是腺病毒主要的中和抗原。
2. PENTON base
3. fiber 和CAR，CD46，hDSG2受体结合，主要产生交叉保护型中和抗体。（fiber又由三部分组成，tail，shaft，Knob），一些研究表明在疫苗接种小鼠，人类或者自然感染人群中会也产生针对fiber knob的有功能性的中和抗体。

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实验用材料：
HAdV11 Slobitski毒株 (GenBank accession no.AF532578.1)
HAdV35 Holden 毒株 (GenBank accession no. AY128640.2)
HAdV3 GZ01毒株 (GenBank accession no. DQ099432)
HAdV-4 GZ01毒株 (GenBank accession no.KF006344.1)
HAdV7 GZ08毒株(GenBank accession no. GQ478341.1)
HAdV14p1 GZ01毒株(GenBank accession no. JQ824845.1)
HAdV55 Shanxi-Y16毒株(GenBank accession no. KF911353.1)
所有腺病毒毒株在HEp-2或者AD293 细胞中培养。
氯化铯密度沉淀纯化病毒颗粒
病毒颗粒滴度通过分光光度计OD值转换计算而得（260nm处1OD值=1.1 × 10^12 VPs)

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重组蛋白HAdV11FK的表达和多抗制备
HAdV11的123–325位氨基酸（包括knob-部分shaft）插入到 pQE30表达载体，表达纯化。
表达的蛋白在非变性条件下为三聚体形式（见图a)。
同时，也表达 HAdV3, HAdV4，HAdV7, HAdV14p1, HAdV55，HAdV35 的fiber蛋白。
多抗制备：
5只雌性4-6周龄的BALB/c小鼠。
腹腔注射纯化的蛋白

HAdV11FK，首次注射剂量为40-50ug/只（加完全弗氏佐剂）

每2周加强免疫，三次，加强免疫注射剂量为40-50ug/只（加不完全弗氏佐剂）

最后一次免疫10天后，眼眶采血，分离血清。

产生的多抗和病毒颗粒中的fiber结合，三聚体形式和多聚体形式均能看到阳性条带，除了和HAdV11结合外，和 HAdV55, HAdV14p1，HAdV7有交叉结合(见图b）。

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ELISA结果：
c包被抗原为纯化的各型病毒fiber蛋白
d包被抗原为纯化的病毒颗粒。
结果显示产生的HAdV11FK多抗和3/7/14P1/55fiber蛋白均有交叉反应。
而包被病毒颗粒的ELISA结果显示和3型没有交叉反应。


中和活性实验结果：


和11型病毒结合能力最强，3型最弱。

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单抗制备：
6-8周龄BALB/c小鼠，腹腔注射纯化的蛋白HAdV11FK
首次注射剂量为50ug/只（加完全弗氏佐剂）

每2周加强免疫，三次。

前两次加强免疫注射剂量为50ug/只（加不完全弗氏佐剂）

最后一次加强免疫注射剂量为20ug/只（加不完全弗氏佐剂）静脉注射，蛋白溶于PBS中。

最后一次免疫3天后，取脾脏，制备杂交瘤。

用HAdV11FK

作为抗原，ELISA进行筛选

用有限稀释法处理细胞，放大培养。

用杂交瘤细胞免疫小鼠，产生腹水，ELISA检测腹水滴度，

通过辛酸-硫酸铵沉淀纯化腹水得到相应的单抗。

病毒中和实验筛选鉴定单抗的中和活性。

在制备的14株单抗中筛选到三株中和活性高的抗体，6A7, 3F11，3D8，都是IgG1/k型

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三株单抗和其他型腺病毒的交叉中和反应
A 以不同型抗体的fiber蛋白作为抗原，单抗6A7和3F11与HAdV11FK, HAdV7FK，HAdV55FK结合，不和HAdV3FK，HAdV14p1FK结合。单抗3D8和HAdV11FK, HAdV7FK,  HAdV55FK结合，和HAdV14p1FK有较弱的反应。
B 以纯化的病毒颗粒作为抗原，单抗6A7和HAdV11反应，和HAdV7有较弱的反应，和HAdV3, HAdV14p1，HAdV55没有反应。单抗3F11和 HAdV11, HAdV7，HAdV55反应，但是不和HAdV3以及HAdV14p1反应，单抗3D8和HAdV11, HAdV7，HAdV55结合，和HAdV14p1有较弱的结合。
C 中和活性实验显示单抗3F11和3D8和HAdV11,HAdV7, HAdV55有交叉中和反应，但是和HAdV14p1没有中和作用，而单抗MAb 6A7和HAdV7, HAdV55, HAdV14p1 都没有交叉中和作用。

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三株单抗和不同型的腺病毒之间WB结果：

3F11单抗：
能识别天然的HAdV11纤维蛋白(lanes 3和10)， HAdV11FK蛋白(lane 4) ，不识别变性下的HAdV11纤维蛋白(lanes1和8)， HAdV11FK蛋白(lane 2) 。
识别天然的HAdV7纤维蛋白(lanes 11)， HAdV7纯化的fiber蛋白knob(lane 4) 。
识别天然的HAdV55纤维蛋白(lanes 12)， HAdV55纯化的fiber蛋白knob(lane 6) 。
不识天然的HAdV14p1纤维蛋白(lanes9)，HAdV14p1纯化的fiber蛋白knob(lane5) 。

3D8单抗：
能识别天然的HAdV11纤维蛋白(lane 7)， HAdV11FK蛋白(lane 2) ，不识别变性下的HAdV11纤维蛋白(lane 8) 。
识别天然的HAdV7纤维蛋白(lanes 6)， HAdV7纯化的fiber蛋白knob(lane 3) ，并且是识别纤维蛋白的单体，三聚体和六聚体。
识别天然的HAdV55纤维蛋白(lanes 5)， HAdV55纯化的fiber蛋白knob(lane 4)，也是识别纤维蛋白的单体，三聚体和六聚体。
识别天然的HAdV14p1纯化的fiber蛋白 knob(lane 1) ，并且只和单体结合。和天然的HAdV14p1纤维蛋白(lanes9)结合能力很弱。
和ELISA结果一致。
6A7单抗：
识别天然的HAdV11纤维蛋白(lane 3)， 不识别变性下的HAdV11纤维蛋白(lanes 4) 。
和天然的HAdV7纤维蛋白有微弱结合(lane 2)
不识别天然的HAdV55纤维蛋白(lane 1)

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序列比对和分子对接进行表位分析
HAdV14p和变异株HAdV14p1之间的最显著差异在于纤毛蛋白KNOB基因中突变株缺失6个核苷酸。
HAdV55来自病毒型间重组，主要是肾致病原 HAdV11和呼吸道致病原HAdV14在六邻体蛋白基因之间发生重组，此外，fiber基因也有一些重组。
HAdV55和HAdV14p毒株的fiber蛋白氨基酸序列一致。
将HAdV11, HAdV7,HAdV14p1, 和HAdV55的纤毛蛋白knob多肽进行对比，存在一些氨基酸序列的差异。


A-J代表β-折叠结构。
HAdV14p1, 和HAdV55之间显示有3个氨基酸的差异
一处突变位于138I(HAdV55 fiber) vs. 138 V (HAdV14p1 fiber)
一处缺失位于HAdV14p1 fiber (249R--E250)vs. HAdV55 fiber (249REKE252)
单抗3F11和3D8能中和HAdV11, HAdV7, HAdV55，但是不能中和HAdV14p1。
ELISA和WB实验显示单抗3F11能识别HAdV11,HAdV7, HAdV55纤毛蛋白结，但是不能识别HAdV14p1。说明251KE252 可能是单抗3F11识别的重要空间表位。