Construction and application of chimeric virus-like particles of tick-borne e...

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三种表达黄热病毒C-M-E的表达载体，pcTBECME，pcTBEC-JEME， pcJECME分别进行单独表达，以及和pcTBENS2B/3质粒共表达。

检测①C-prM蛋白能否切开；②细胞培养上清中有无prM和E蛋白的亚病毒分泌颗粒。

结果发现没有和pcTBENS2B/3质粒共转染，没有NS2B-NS3蛋白表达，就无法进行C-prM连接处的切割。C-prM-E结构蛋白无法释放到上清中。

同时解释了图三中pcJECME和复制子共转染后，上清中能检测到微量E蛋白的存在，可能是因为产生了少量的亚病毒颗粒。

结果可以看到TBEV的NS2B./3能识别JEV C-prM连接处并且进行切割。

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Neutralizing test for VLP infection of BHK-21 cells

1H4:TBEV单抗，4H8：黄热病毒属其它病毒的抗原，和TBEV，JEV有交叉反应；

检测两种VLPs的抗原性（TBE-E蛋白，JEV-E蛋白），基本上是和活病毒感染颗粒E蛋白的抗原性保持一致。

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Infectivities of TBE-envelope andJE-envelope VLPs for arthropod cells

检测VLPs在蚊源/蜱源细胞中的复制能力，感染能力。ISE6：蜱源细胞；C6/36：蚊虫细胞。

感染性病毒颗粒以MOI=1感染ISE6或者C6/36细胞，吸附1小时后，收获上清，检测上清中VLP滴度。

细胞用0.1mg/ML链蛋白酶处理40分钟，以阻止VLPs和细胞表面的非特异性结合。病毒颗粒感染细胞后1，2，4，8小时收获细胞样本，提取RNA，进行RT-PCR。

PCR产物包括TBEV 5′-UTR和NS1之间的区域，蚊虫和蜱的β-actin基因作为标准品。

TBEV以及TBEV病毒样颗粒能感染ISE6细胞。

JEV能感染C6/36细胞，但是JE-TBEV嵌合型的病毒样颗粒感染C6/36细胞后没有检测到蛋白表达。

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为了探究JE-TBEV嵌合型病毒颗粒缺乏对蚊虫细胞和蜱虫细胞感染性的机制，进一步检测不同的病毒样颗粒感染不同细胞后的内化作用。

可以看到图a中TBE-E VLPs感染蜱细胞后，上清中VLPs残余量很少，JE-E VLPs正好相反。

RT-PCR检测细胞内病毒RNA的含量，可以看到JE-E VLPs不能进入蜱虫细胞，能进入蚊虫细胞C6/36，但是感染蚊虫细胞后在第8小时，已经检测不到RNA的存在，说明JE嵌合型VLPs能感染蚊虫细胞，但是进入细胞后不能复制，可能是和复制子来源于TBEV有关。这也解释了为什么图5中JE-E VLPs感染C6/36细胞后IFA检测为阴性。

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近年来，成功构建很多黄热病毒嵌合体，可用来研究黄热病毒的生物学特性和疫苗研制。本研究首篇报道蜱传脑炎病毒和蚊传脑炎病毒的一次感染性嵌合体。
讨论中的几个亮点：
1 pCJECME和TBEV复制子载体共转染细胞后，C-prM连接处是能被NS2B-3酶识别并且切割开的（图3，5），但是VLPs产量非常低，说明除了C-prM的加工是病毒成熟和包装所必须之外，还有其他原因参与了病毒的包装，比如C蛋白和基因组RNA的同源性很重要。
2 图3b所示，pCJECME和TBEV复制子共转染后，分泌到上清中的E蛋白不多。但是图3所示，pCJECME和pCTBENS2B-3共表达后，分泌到上清中的E蛋白比较多，说明在复制子RNA复制过程中，一些因素操控了病毒颗粒的包装和释放，使得E蛋白停留在细胞内而得不到有效的释放。
3 黄热病毒颗粒要通过受体介导的内吞作用进入细胞，病毒膜蛋白和核膜融合，基因组RNA和C蛋白分离，进行复制。利用嵌合病毒VLP系统能区分病毒内化和病毒复制两个过程，从而判断病毒感染细胞各蛋白具体在哪个环节中发挥作用。
4 从各种迹象表明，病毒C蛋白和复制子非结构蛋白/基因组RNA的同源性，对于病毒有效的包装和分泌至关重要。提示这些有利于寻找黄病毒的包装信号。
5 VLPs可以代替病毒颗粒用于血清诊断学实验。