Yellow Fever/Japanese Encephalitis Chimeric Viruses:

傲慢与偏见

Yellow Fever/Japanese Encephalitis Chimeric Viruses: Construction and Biological Properties

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摘要
目的：利用YF-17DD疫苗株基因组为骨架载体，用日本脑炎病毒结构蛋白prM和E基因替换YF-17DD的相应区域，构建YF/JE嵌合病毒。
方法：嵌合病毒的结构蛋白prM和E基因来自于两个日本脑炎病毒株，一个是 SA14-14-2(人类疫苗株) ，一个是JE Nakayama (JE-N，经鼠脑传代的毒株）。构建成功的嵌合病毒在细胞/实验小鼠进行检验。
结果：JEV的E蛋白和黄热病毒的核衣壳蛋白公同表达，则能保留病毒的抗原性和生物学特性。而YF病毒嵌合了JEV全部结构蛋白C-prM-E的cDNA克隆是无法得到拯救病毒。YF/JE(prM-E)嵌合病毒和原病毒株一样，能在脊椎动物细胞和蚊虫细胞中有效地生长。1000000pfu的嵌合病毒YF/JE SA14-14-2经过脑内注射，对成鼠没有致死性，说明无神经毒性。而YF/JE-N嵌合病毒保留有神经毒性，但是其表型更像YF-17DD，而不像JE-N。两种嵌合病毒的基因组之间有十个氨基酸的不同，预测其中一两个位点可能和神经毒性有关。
结论：这些结果说明用YF-17DD作为载体，构建嵌合病毒作为减毒活疫苗的可行性，并且可以用YF-JE嵌合病毒系统可以用于研究E蛋白与神经毒性相关的相关毒力位点。

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背景资料：
黄热病毒和日本脑炎病毒同属黄热病毒属，但是很多特性截然不同。
两种病毒具有不同的抗原性，蚊虫载体和脊椎动物宿主也没有共同性，人类感染后出现的症状也各不相同。
鉴于黄热病毒属病毒的病毒基因组结构很保守，复制能力相似，之前有同属病毒的两个病毒株TBE和DEN之间也成功构建出嵌合病毒。
本研究尝试构建YF-JE的嵌合病毒，用于鉴定能否获得重组的减毒活疫苗株，以及研究在黄热病毒复制和致病性中，蛋白-蛋白，RNA-蛋白之间的相互作用。

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主要试剂和材料：
细胞：SW-13(人肾上腺皮质小细胞癌细胞), Vero, LLC-MK2, C6/36, NB41A3 (小鼠神经母细胞瘤)
YF5.2iv (黄热病毒疫苗株YF17D 的分子克隆)
JE病毒株 Nakayama (JE-N) ，JE SA14-14-2疫苗株，在LLC-MK2细胞上能放大培养。
质粒构建：
两质粒法（two plasmid system）构建嵌合型cDNA，利用Nhe I和BspE I双酶切处理载体获得嵌合基因组全长作为模板。
所有RNA模板通过SP6转录酶进行体外转录而获得。转染用量：100-250ng RNA转染VERO细胞，转染试剂为lipofectin。

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获得YF/JE嵌合病毒:
YF5.2iV病毒（YF-17DD的拯救病毒）在Vero细胞上的产量是6.1log10 PFU/ml。
S：SA14-14-2疫苗株；N：Nakayama毒株
在YF-17DD骨架上嵌入两种JE病毒的prM-E区基因，可以获得拯救病毒。YF/JE-S prM-E和YF/JE-N prM-E嵌合病毒在Vero细胞上产量分别是 6.8 和7.3。
log10 PFU/ml,


在YF-17DD骨架上嵌入两种JE病毒的C-prM-E区基因，不能获得拯救病毒。

收获后的拯救病毒再次感染新细胞，提取细胞总RNA，用RT-PCR方法扩增嵌合病毒基因组不同处的基因片段，证实为嵌合型病毒。

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病毒蛋白的鉴定：
野生病毒或者拯救病毒感染（moi=1）Vero/LLC-MK2细胞，感染后48小时后，用[35S]甲硫氨酸标记10-12小时，收集培养液上清或者细胞裂解物在变性或者非变性条件上用黄热病毒或者乙脑病毒的单抗/多抗检测病毒蛋白的存在。

YF5.2iv用黄热病毒多抗能检测到YF E蛋白的存在，大约50KDa。
JE-S，YF/JE-S，YF/JE-N，JE-N用乙脑病毒多抗检测到JE E蛋白，大约为52KDa.
YF-E和JE-E蛋白大小的差别和JE-E蛋白的糖基化有关。进一步鉴定病毒各蛋白的糖基化情况。

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蛋白糖基化位点的鉴定：
野生病毒或者拯救病毒感染Vero细胞后48小时后，用[35S]甲硫氨酸标记6小时，标记的过程中用7.5ug/ul的衣霉素处理细胞。

YF的E蛋白没有糖基化位点，明显不受衣霉素的影响，大小没有发生任何改变。
JE的E蛋白N端存在一个糖基化位点，衣霉素处理后蛋白由52kDa减小到50kDa。

YF的prM蛋白存在两个糖基化位点，JEV的prM存在一个糖基化位点。
衣霉素处理后JE的prM蛋白由19kDa减小到17kDa。
YF的prM蛋白存在两个糖基化位点，大小约24kDa，用衣霉素处理后检测不到蛋白的存在，猜测可能和YFV的prM蛋白不够稳定的缘故。

NS1蛋白存在两个糖基化位点，在加了衣霉素处理后，可以看到蛋白的分子量减少了4kDa左右。

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JEV和YFV的免疫交叉作用：

A: 用JEV的E蛋白单抗检测YF，YF/JE-N，YF/JE-S三种病毒，嵌合病毒中的JE E蛋白能够检测到，而YF的E蛋白检测不到，说明JE的E单抗和YFV E蛋白无交叉免疫作用。

B：用非免疫性腹水，YFV血清多抗，JEV血清多抗检测YFV病毒，两种多抗均和YFV E蛋白结合，说明YFV和JEV两种病毒的E蛋白之间存在交叉反应，非中和性表位。
C：用非免疫性腹水，YFV血清多抗，JEV血清多抗检测YF/JE-N嵌合病毒，两种多抗均和嵌合病毒中的JEV E蛋白结合，和B一样说明YFV和JEV E蛋白之间存在交叉反应，非中和性表位。

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中和抗体实验：
用NI-AS（非免疫血清），YF-AS（黄热腹水多抗），JE-AS（乙脑腹水多抗）。NI-IgG（非免疫性IgG)，YF-IgG（黄热单抗IgG），采取病毒噬斑减少中和实验检测YFV病毒，JEV病毒，和嵌合病毒。
各类型抗体对不同病毒有不同的中和活性。

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病毒生长曲线：
野生病毒或者拯救病毒感染（moi=0.5）LLC-MK2，C6/36，SW-13，NB41A3细胞，每12-24小时收获培养液，在LLC-MK2细胞中检测病毒滴度。

不同病毒感染细胞后都是在48小时能达到最高值。
嵌合病毒和JEV的复制生长能力都比YF5.2iv强。
YF/JE-S复制能力高于SA14-14-2，而JE-N复制能力比YF/JE-N要好。
不同病毒达到的最大滴度量也各不相同。

在蚊虫细胞C6/36细胞中, 嵌合病毒和野生株复制能力相似。
在SW-13细胞中，YF/JE-N复制能力高于YF/JE-S。
在NB41A3细胞中，YF/JE-S 和YF5.2iv复制能力相似，而 YF/JE-N显示了较低的复制能力。