HuCAL 全人源全合成抗体库技术

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  2000年，德国Morphosys AG公司详细报道了一个全人源抗体库（ HuCAL）的实验设计路线和全合成构建过程。

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该抗体库是全合成抗体库的经典代表，其设计思路和技术方法也一直是后来同类研究参考和模仿的范本。
如今，HuCAL抗体库经过不断优化、三代更新，已成功筛选到百株以上的商品化抗体，其中20余种抗体进行临床实验，两项获FDA批准上市。

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人的胚系抗体基因包括6个VH家族，7个VK家族，10个Vλ家族。
通过聚类分析Kabat和Genbank数据库中的675个VH，386个VK，149个VL已知的抗体序列。在比较抗体胚系基因家族结构、序列和使用频率的基础上，构建HuCAL库最终选定了7个重链可变区框架和7个轻链可变区框架，覆盖了人类抗体多样性的95％左右。

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在全合成抗体主要框架基因时，首先对设计的抗体基因序列进行密码子优化，使其更易于在大肠杆菌中表达。同时，将主架中的CDR区设计成易于替换的盒式结构，在CDR3区的两侧添加酶切位点，方便CDR3区的替换，实现抗体库的模块化，为库的增容和亲和力成熟打下基础。

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第一代抗体库为ScFv抗体库，一共合成7个VH主架和7个VL主架，两两进行组合后得到49种主架序列。将已知抗体4D5的轻重链CDR3序列分别插入到合成库CDR3区，产生的49个ScFv单链抗体均能在周质腔中，以分泌形式进行正确表达。
采用TRIM三联核苷酸突变技术，构建CDR3区的库，预先合成除终止密码子之外的所有氨基酸的三联碱基，以这些三联碱基为基本单位，合成随机化的CDR区，可以在任意位置引入需要的氨基酸序列，可以控制长度，因此能有效地避免了氨基酸的偏好性，同时保证了CDR3区的多样性。合成好的轻重链CDR3区插入到主架序列中，得到有49个子库的抗体库，总库容量达2×10^9。
对HuCAL库进行性能鉴定，发现筛选到的抗体中，VH3以及VK3，Vλ3更多被筛选到，在利用率上存在一定的优势。

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HuCAL GOLD是在HUCAL一代的基础上进行一些功能改进，库容量也有所提高。抗体基因由ScFv形式改变为Fab形式，引入β-内酰胺酶筛选策略，可以纠正抗体库中抗体基因的移码突变，提高抗体库的正确率，引入其CysDIsplay专利技术进行呈现，在噬菌体pIII蛋白和Fab蛋白之间引入S-S二硫键，可以用还原剂进行洗脱，HuCAL GOLD的库容量达到1.6×10^10。

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HuCAL PLATINUM对二代抗体库进一步改动，依旧采用TRIM三联核苷酸突变技术，对六个CDR区进行置换，在CDR3中引入长度的变化以增加多样性，并对主架基因进行了重新设计，去除一些mRNA的二级结构序列，负调控序列，减少CDR区的糖基化序列，提高抗体在哺乳动物细胞的表达水平，总库容达到4.5×10^10，正确率超过70%。

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2012年12月，MorphoSys的诊断和研究用抗体研究部门（AbD Serotec）被Bio-RAD收购，授权HuCAL抗体库技术用于诊断和研究抗体的制备和定制服务。目前在Bio-Rad官网上可查到的利用该抗体库制备的在售商品有100多种，采用这个抗体库筛选单抗具有研发周期短（8周），成功率高（>90%）的显著优势。筛选流程如下：

① 抗原包被：可以采用磁珠或者免疫管，酶联板进行抗原的包被。

② 吸附-洗涤-洗脱，三轮。

③ 收集三轮筛选富集后的噬菌体，提取总的噬菌粒DNA，将混合的抗体基因序列库亚克隆到Fab表达载体中，重新转化感受态细菌，涂布在平皿上，理论上，长出的每一个菌落含有一种抗体基因的表达载体质粒。

④ 初筛，挑取384个菌落（有精力的话，可以挑更多），诱导表达后，裂解细菌，间接ELISA检测上清中表达抗体和抗原特异性结合，还可以根据WB，抗体的解离常数等进一步鉴定抗体活性。

⑤ 测序，分析抗体序列。

⑥ 根据抗体类型，表达标签等等的需求，选择表达载体进行抗体的表达（如下图）。

⑦ 质量鉴定，检测抗体特异性，纯度等等。

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