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青花瓷

A strategy for high-level expression of a single-chain variable fragment against TNFa by subcloning antibody variable regions from the phage display vector pCANTAB 5E into pBV220

protein expression and purification
76（2011）109-114

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TNF-a的噬菌体单链抗体库中得到的单链抗体。单链抗体基因克隆到 pCANTAB-5E进行原核表达时，产量约为0.15mg/L。
将单链抗体基因重新克隆到pBV220载体中，能提高表达量超30%，多为包涵体表达。
三角瓶培养，产量约为45mg/L，湿重为15mg/g。变性纯化后的Scfv和可溶性的ScFv功能一致。

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重组噬菌体抗体系统(RPAS)现在广泛用于展示和生产scFv。常用的噬菌粒载体pCANTAB 5E，能有效进行操作原核表达，只是产量比较低。
因此在本文中尝试使用pBV220表达载体，实现高表达。
选择用一个靶向TNFa的单链抗体用于研究。

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使用材料：
噬菌粒载体pCANTAB 5E，（Amersham Biosciences ，Germany)，质粒pBV220。 BL21 (DE3)  (Novagen，Germany). E. coli TG1, HB2151，M13KO7辅助噬菌体。
鼠纤维肉瘤细胞系 L929,。
抗His的单抗，HRP-鼠抗M13的单抗，抗E-标签单抗。
HRP-山羊抗小鼠IgG，抗-TNFα单抗
自己构建的HBsAg-scFv
重组蛋白human (rh) TNFa, rhTRAIL
HiTrap 抗E标签预装柱(Amersham Biosciences ，Germany).
Qiagen购买的Ni–NTA琼脂。

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小鼠免疫
5个BALB/c雌性小鼠，腹腔注射每次5ug的rhTNFa，溶解在100ul的PBS中。第15和30天，再次免疫，第40天时，取脾收集淋巴细胞，制备RNA。
构建噬菌体库：
引物购自(Amersham Biosciences, Germany) ，通过(Gly4Ser)3 将VH和VL进行串联。
插入到噬菌粒pCANTAB 5E中。
转化E. coli TG1进行噬菌体的展示。
通过固相筛选，用rhTNFa蛋白进行三轮的筛选。筛选得到针对TNF-a的鼠单抗
转化E coliTG1细菌，库容量约为5×10^8三轮筛选，每轮的投入量均为2×10^12。
产出量则递增，分别是3.5×10^4，7.5×10^6，6×10^8。富集了17000倍。
挑选了90个单克隆进行phage-ELISA鉴定，一共有27个阳性克隆。
以白蛋白作为阴性对照，其中25个克隆特异性很好，选择其中一株5B18单抗进行接下来的研究。

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表达和纯化pCANTAB 5E-scFv
pCANTAB 5E-scFv转化到HB2151，2-YT培养4小时后，加0.5 mM IPTG进行诱导。用20ml的冰预冷Buffer进行重悬(0.5 M蔗糖, 0.5 mM EDTA, 200 mM Tris–HCl, pH 8.0)
冰上孵育30min，离心10,000g×15 min
蛋白为周质表达，大小约为28kda，蛋白表达量占总蛋白的1%，需要超滤进行浓缩，可溶性抗体，用抗E标签的柱子进行纯化。WB也用抗-E的单抗进行鉴定。

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构建pBV220-scFv表达载体：
上游引物：5-AAGGATCCCATGCAGGTGAAACTGGTGGAGTCT-3
下游引物：5-GCGGATCCCTATTA gtggtggtggtggtggtg TCTTTTGAATTC-3
通过BamH I插入到pBV220载体中，转化 E. coli BL21(DE3)菌。

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表达，纯化和折叠pBV220-scFv
转化pBV220-scFv的E. coli BL21(DE3)在OD600 =0.6时，进行温度诱导，从30-42℃。诱导后五个小时，4200g×10min收集细菌。
buffer A (50 mM Tris–HCl, pH=8.0, 3% Triton X-100, 4 M尿素)进行重悬，超声。
蛋白表达量占总蛋白的30%，有一部分是可溶性表达，大部分是包涵体表达。