Efficient Expression from One CMV Enhancer Controlling Two Core Promoters

青花瓷

RNA 提取和反转录PCR
RNeasy Mini Kit (Qiagen,Hilden, Germany)试剂盒完成对细胞RNA的提取，将样品稀释到100ng/ul，用QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen) 对RNA进行cDNA反转录，20ul的反应液取样800 ng RNA。
用Brilliant SYBR Green QPCR Master Mix II (Stratagene, Cedar Creek, TX)对抗体轻重链进行mRNA数量进行分析，以核糖体RNA 14S (RibS14) 作为参考基因。RibS14 (上游引物：5'-gacctcaagtggctgaagga-3', 下游引物5‘-cagtcacccggcagatagtt-3’)
重链恒定区基因： (上游引物：5'-gcttctatcccagcgacatc-3', 下游引物5‘-catcacggagcatgagaaga-3’)
轻链恒定区基因：(上游引物：5'-ctgttgtgtgcctgctgaat-3', 下游引物5‘-tgtaggtgctgtccttgctg-3‘).
反应体系：25ul总体积，包括12.5ul SYBR Master Mix, 200 nM上下游引物，2ulcDNA模板。
反应条件为：  95℃ 10 min, 40个循环（95℃ 15 s，60℃ 1min, 72℃ 30s）

青花瓷

用截短CMV启动子复合物进行稳定表达的细胞系

采用Flp-in系统完成特异性定点整合
T25瓶中接种5ml含量为0.75*10^6的DG5.2细胞，孵育24 h，弃去2.5ml培养基，加18ulFugeneHD，0.9ug Flp重组酶质粒，3.6ug抗体表达载体。3小时后，补加2.5ml新鲜培养基。转染后24小时，用450ug/ml的G418进行筛选， 通过b-gal染色对阳性细胞进行鉴定。

青花瓷

用于建立稳定表达细胞系，转染的抗体表达载体有2*CMV，TCMV-C，TCMV-D。结果和瞬时表达并不一致，没有相关性。瞬时表达中，TCMV-C和2*CMV表达水平接近，TCMV-D表达量最低。
而稳定表达中，表达水平为：TCMV-D>TCMV-C>2*CMV
TCMV-D的抗体表达量最高，是TCMV-C的两倍，是2*CMV的12倍。
荧光定量PCR显示，TCMV-D轻链mRNA和TCMV-C重链mRNA之比有1.6倍的差异。2*CMV的轻链重链mRNA水平最低。

青花瓷

瞬时表达和稳定表达的各质粒轻重链mRNA之比没有改变。
说明表达水平的改变不是由启动子复合物中的单个启动子的改变而引起的。
FRT位点周边的基因组序列通过方向依赖性干扰影响到启动子复合物的转录活性。
各质粒轻重链mRNA量用参考基因的mRNA量进行标化。可以看到瞬时和稳定表达进行比较，2*CMV的相对量降低，HCMV-C保持不变，HCMV-D上升。