Production and Characterization of Novel Camel Single Domain Antibody Targeti...

青龙偃月刀

Production and Characterization of Novel Camel Single Domain Antibody Targeting Mouse Vascular Endothelial Growth Factor

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摘要：
纳米抗体=骆驼单抗的VHH区
本文通过四轮筛选，筛选到两株抗鼠VEGF纳米抗体Nb5和Nb10 。
筛选到的纳米抗体在WK6细菌中表达，对特异性和亲合力进行检测。

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背景资料
VEGF是一种血管内皮细胞的特异性有丝分裂原，在体外可促进血管内皮细胞的生长，在体内可诱导血管增生。
VEGF是最强的可增加血管通透性的物质之一
VEGF参与许多血管生成依赖性疾病的发病及其进展，包括癌症、某些炎性疾病以及糖尿病视网膜病变等。小鼠体内VEGF基因通过不同的剪接，编码具有120，164，188个氨基酸等异构体。
VEGF和VEGFR受体结合，诱发内皮细胞生长和血管增生。
采用单抗或者小分子和VEGF结合，抑制VEGF和受体结合。
本文主要描述了两个VEGF的纳米抗体的筛选和鉴定。
纳米抗体比较适合诊断和治疗用，有很多优点，尤其是纳米抗体可以穿透实体瘤，作为药物有很大优势。
一个名为Ablynx的药厂有几个处于不同临床实验阶段的纳米抗体。

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实验使用材料
表达纯化的mVEGF蛋白。
HRP-抗M13抗体，HRP-抗his抗体，HRP-抗HA抗体。
pHEN4和pHEN6载体
M13K07辅助噬菌体
构建纳米抗体天然抗体库主要采用丝状噬菌体展示系统进行。通常步骤为：
（1）驼科动物外周血淋巴细胞采集；（2）提取总mRNA；（3）反转录为cDNA；（4）PCR扩增获取纳米抗体基因片段；（5）构建重组载体；（6）电转化构建初级库；（7）库容量鉴定。

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构建噬菌体库
纳米抗体基因来源于mVEGF免疫后的骆驼血，噬菌体载体为pHEN4，细菌库容量为10^8，纳米抗体基因和pIII蛋白融合。
ELISA板包被1ug/孔的mVEGF，用于筛选抗体库中的纳米抗体，经过四轮筛选，阳性克隆得到富集。

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通过四轮筛选，和mVEGF有结合能力的噬菌体得以富集。

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挑选单克隆进行噬菌体-ELISA进一步进行特异性筛选，筛选到两株抗鼠VEGF纳米抗体Nb5和Nb10 。

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将两株纳米抗体Nb5和Nb10基因克隆至载体pHEN6C中，转化WK6细胞。
诱导表达，从周质中提取表达的蛋白。
WB检测如预期

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两株纳米抗体的特异性检测
两株抗体均和商品化的以及本实验室纯化的VEGF有特异性结合，而和其它抗原如hVEGF，EGF等不结合。

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两株抗体的亲合力测定