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楼主: 青龙偃月刀

关于纳米抗体的读文献笔记

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 楼主| 发表于 2021-3-18 15:45:20 | 显示全部楼层
纳米抗体库的人源化:
1. 表面氨基酸人源化法
纳米抗体人源化的一般原则是在有效地降低免疫原性的同时,能够保证较高的亲和力、活性、热稳定性和产量等。
VHH人源化第一步可考虑对骨架区FR2进行改造,即将4个疏水性残基分别突变为人VH 的亲水性残基。
对VHH FR2骨架区进行人源化首先分别对4个残基进行突变或通过生物信息学模拟找出对构象影响较小的残基。
在选择好对FR2突变的位点后,考虑对其他3个骨架区(FR1、FR2以及FR3)进行人源化。
研究发现另外3个骨架区对VHH空间构象的影响不大,因此可通过计算机模拟或与人胚系基因对比分析进行人源化改造。
2.VHH人源化通用框架移植法


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 楼主| 发表于 2021-4-26 14:02:16 | 显示全部楼层
①VHH 中的CDR3 区更长,并且可
以通过形成稳定而丰富的大凸环抗原结合构
象[3],嵌入抗原分子的裂缝及沟槽中,提高了抗体
的特异性和亲和力,也使其具有广泛的抗原结合活
力; ②VHH 的CDR1 区和FR2 区存在半胱氨酸残
基(Cys),可以与CDR3 区中的Cys 残基形成二硫
桥,使可变区的稳定性增强[4-5];③VHH 缺少Fc 段,
避免了补体反应,因而免疫原性较弱,生物相容性
较好[6];④VHH 抗体表面约有10 个不同于VH 抗
体的氨基酸,更易进行改造;⑤VHH 包含更多的目
标抗原表位[7];⑥VHH 抗体片段对不同的温度有极
大的稳定性[8];此外,VHH 抗体能在细胞内很好地
发挥功能,对酶类的中和作用较强,这些特点也大
大促进了其在生物体内免疫代谢的调节作用[9]。

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 楼主| 发表于 2021-4-30 14:51:33 | 显示全部楼层
CALL001引物:
和驼类VH/VHH基因的信号肽区一致,和人类-3VH基因高度同源。
CALL002引物:
和驼类IgG重链的CH2区基因保守序列一致,能用于驼类mRNA第一链的反转录PCR扩增。

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 楼主| 发表于 2021-6-12 10:11:36 | 显示全部楼层
本帖最后由 青龙偃月刀 于 2021-6-25 21:59 编辑

Nb和传统抗体的可变区结构类似,由2个β束组成2个β-片层。通过LOOP区的Cys23和Cys104形成常规二硫键进行连接。
人和鼠VH的CDR3平均长度分别为12和9个氨基酸,而纳米抗体CDR3为13~18个氨基酸,在一定程度上弥补了轻链缺失造成的抗原结合力下降;
传统抗体的FR2中,V37、G44,L45和W47这4个氨基酸残基参与VL的相互作用,而在Nb中,这4个氨基酸突变为F/Y37,E/Q44,R/C45,G/F/S/L47,由疏水氨基酸突变为亲水氨基酸,使纳米抗体更易于溶解。
除本身存在的FR1(Cys22)与FR3(Cys92)二硫键外,分子内CDR1(或FR2)与CDR3有一对二硫键,帮助进一步稳定CDR3所成型的凸环结构。


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发表于 2021-6-12 15:21:24 | 显示全部楼层

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 楼主| 发表于 2021-6-20 10:33:03 | 显示全部楼层
Vobarilizumab(ALX一0061)纳米抗体是由抗IL-6R和抗白蛋白纳米抗体耦合而成,通过与IL一6受体相结合,从而用于自身免疫性疾病的治疗。

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 楼主| 发表于 2021-6-20 10:52:15 | 显示全部楼层
本帖最后由 青龙偃月刀 于 2021-6-25 11:45 编辑

从目前进入临床阶段的情况来看,纳米抗体主要以双价、多价、PEG修饰、Fc融合以及白蛋白融合等方法出现,这样不仅可以增加药物的疗效,也可以延长药物半衰期。

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 楼主| 发表于 2021-6-20 10:59:06 | 显示全部楼层
骆驼科共分为3属6种动物,骆驼属包括单驼峰(One-humped Camelus dromedaries)和双驼峰(Two.humped Camelus bactrianus);大羊驼属的3种:美洲驼(Lama glama)、羊驼(Lama vicugna)、原驼(Lama guanicoe);小羊驼属的一种:骆马(Vicugnapacos)。

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 楼主| 发表于 2021-6-20 18:02:59 | 显示全部楼层
本帖最后由 青龙偃月刀 于 2021-6-21 08:53 编辑

纳米抗体作为一个研究工具
作为研究工具的多功能亲和试剂应该很容易产生,靶标特异性好。
有时,亲和试剂需要在不影响靶标的情况下识别所有的构象结构,也可能只识别某一个构象结构,从而能调节和影响到靶分子的功能。好的亲和试剂在不同的细胞室里发挥功能。
reagent should be functioning in different cellular compartments.

Nbs like many other affinity reagents fit perfectly
in this picture. Their high specificity for one
particular conformation of the Ag makes that the crystallisation
of the Nb-Ag complex is highly successful,
even for dynamic molecules [103]. As a result, well over
200 protein crystal structures were solved, of which the
vast majority of proteins failed to have their structure
determined at high resolution [114]. Nbs were also
instrumental to identify the interaction side of subdomains
of large proteins or to investigate in real time the
protein–protein interactions within a cell and for superresolution
microscopy [94,115,116]. The function of
native enzymes has been knocked out or modified, even
intracellularly, after direct Nb binding, by mediating the
proteolysis of the Ag [97,99], by its rerouting to other
cellular compartments or by keeping the Ag at a location
where it is not functioning [101,117,118]. Such functional
knockouts are of significant interest in cell
biology or in unveiling the life cycle of infectious pathogens.
Also tracking and the study of the dynamics of the
Ag inside cells became feasible with chromobodies or
LlamaTags, obtained after intracellular expression of a
Nb-fluorescent protein gene construct [92,119].


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 楼主| 发表于 2021-6-25 12:14:30 | 显示全部楼层
纳米抗体对人体的免疫原性较弱, 且与人的生物相容性好。
经比较, 骆驼的V H H 胚系基因序列与人的V H 3 序列高度同源.
不同的地方主要有两点: 一是骆驼的VHH的CDR3长度比人的稍长, 二是VHH与人VH表面大概只有10 个氨基酸不同。因此可对骆驼v H H 进行简单的改造从而使其人源化。

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